Reacción en cadena de la polimerasa, Principios y el procedimiento de PCR, Etapas de PCR, Aplicación de la PCR, Las variaciones en la técnica básica PCR, Historia

La reacción en cadena de la polimerasa es una tecnología bioquímica en la biología molecular para amplificar una sola o unas pocas copias de un fragmento de ADN a través de varios órdenes de magnitud, la generación de miles a millones de copias de una secuencia particular de ADN.

Desarrollado en 1983 por Kary Mullis, la PCR es ahora una técnica común y, a menudo indispensable utilizado en los laboratorios de investigación médica y biológica para una variedad de aplicaciones. Estos incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, o el análisis funcional de los genes; el diagnóstico de enfermedades hereditarias, la identificación de las huellas dactilares genéticas, y la detección y el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. En 1993, Mullis recibió el Premio Nobel de Química junto con Michael Smith por su trabajo en PCR.

El método se basa en el ciclo térmico, que consiste en ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reacción de fusión del ADN y la replicación enzimática del ADN. Los cebadores que contienen secuencias complementarias a la región de destino a lo largo con una ADN polimerasa son componentes clave para permitir la amplificación selectiva y repetida. A medida que avanza la PCR, el ADN generada no es utilizado como una plantilla para la replicación, poniendo en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN se amplifica exponencialmente. PCR puede modificarse ampliamente para llevar a cabo una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Casi todas las aplicaciones de la PCR emplean una ADN polimerasa termoestable, tal como Taq polimerasa, una enzima originalmente aislada de Thermus aquaticus la bacteria. Este ADN polimerasa ensambla enzimáticamente una nueva cadena de ADN a partir de bloques de construcción de ADN, los nucleótidos, mediante el uso de ADN de cadena sencilla como molde y los oligonucleótidos de ADN, que son necesarios para la iniciación de la síntesis de ADN. La gran mayoría de los métodos de PCR utilizar ciclos térmicos, es decir, alternativamente calentamiento y enfriamiento de la muestra de PCR a una serie definida de pasos de temperatura. Estos pasos son necesarios ciclos térmicos primero para separar físicamente las dos cadenas en una doble hélice de ADN a una temperatura alta en un proceso llamado fusión del ADN. A una temperatura inferior, cada hebra se utiliza a continuación como molde en la síntesis de ADN por la ADN polimerasa para amplificar selectivamente el ADN diana. La selectividad de los resultados de la PCR de la utilización de cebadores que son complementarios a la región de ADN específica para la amplificación bajo condiciones específicas de ciclos térmicos.

Principios y el procedimiento de PCR

Se usa la PCR para amplificar una región específica de una cadena de ADN. Mayoría de los métodos de PCR típicamente amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilo pares de bases, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kb de tamaño. La cantidad de producto amplificado se determina por los sustratos disponibles en la reacción, que se convierten en la limitación a medida que avanza la reacción.

Una PCR configuración básica requiere de varios componentes y reactivos. Estos componentes incluyen:

  • Molde de ADN que contiene la región de ADN a amplificar.
  • Dos cebadores que son complementarios a los extremos 3 'de cada una de la hebra sentido y anti-sentido de la diana de ADN.
  • Polimerasa Taq u otra ADN polimerasa con un óptimo de temperatura a alrededor de 70 º C.
  • Desoxinucleósidos trifosfato, los bloques de construcción de la que el ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN.
  • Solución tampón, proporcionando un ambiente químico adecuado para la actividad óptima y la estabilidad de la ADN polimerasa.
  • Los cationes divalentes, magnesio o iones de manganeso, por lo general se utiliza Mg2 +, Mn2 +, pero pueden ser utilizados para la mutagénesis de ADN mediada por PCR, como una mayor concentración de Mn2 + incrementa la tasa de error durante la síntesis de ADN
  • Iones de potasio catión monovalente.

La PCR se lleva a cabo habitualmente en un volumen de reacción de 10-200 l en tubos de reacción pequeños en un termociclador. El termociclador se calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto la calefacción y la refrigeración del bloque de retención de los tubos de PCR simplemente mediante la inversión de la corriente eléctrica. Tubos de reacción de paredes finas permiten conductividad térmica favorable para permitir el equilibrio térmico rápido. La mayoría de los cicladores térmicos han calentado tapas para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Termocicladores mayores que carecen de una tapa calentada requieren una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o una bola de cera en el interior del tubo.

Procedimiento

Típicamente, la PCR consiste en una serie de cambios de temperatura repetidos 20-40, llamado ciclos, con cada ciclo comúnmente que consiste en los pasos 2-3 de temperatura discretas, por lo general tres. El ciclismo es a menudo precedida por un solo paso de temperatura a una temperatura alta, y seguido por una retención en el extremo de la extensión del producto final o de almacenamiento breve. Las temperaturas utilizadas y la longitud de tiempo que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción, y la temperatura de fusión de los cebadores.

  • Paso de inicialización: Esta etapa consiste en calentar la reacción a una temperatura de 94-96 C, que se mantiene durante 1-9 minutos. Sólo se requiere para ADN polimerasas que requieren la activación por calor por PCR de arranque en caliente.
  • Paso de desnaturalización: Este paso es el primer evento de ciclismo regular y consiste en calentar la reacción a 94-98 º C durante 20-30 segundos. Provoca fusión del ADN de la plantilla de ADN al interrumpir los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, produciendo moléculas de ADN de cadena sencilla.
  • Recocido paso: La temperatura de reacción se baja a 50-65 º C durante 20-40 segundos que permiten la hibridación de los cebadores a la plantilla de ADN de una sola hebra. Típicamente, la temperatura de recocido es de aproximadamente 3-5 grados Celsius por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. Enlaces de hidrógeno DNA-DNA estables sólo se forman cuando la secuencia del cebador coincide muy de cerca la secuencia molde. La polimerasa se une al híbrido cebador-molde y comienza la formación de ADN.
  • Paso de extensión/alargamiento: La temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; polimerasa Taq tiene su temperatura óptima de actividad a 75-80 C, y comúnmente una temperatura de 72 C se utiliza con esta enzima. En este paso la ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la cadena molde de ADN mediante la adición de dNTPs que son complementarios a la plantilla en 5 'a 3', la condensación del grupo 5'-fosfato de los dNTPs con el 3'-hidroxilo grupo al final de la cadena de ADN naciente. El tiempo de extensión depende tanto de la polimerasa de ADN utilizada y de la longitud del fragmento de ADN a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la ADN polimerasa se polimeriza un millar de bases por minuto. En condiciones óptimas, es decir, si no hay limitaciones debido a sustratos o reactivos limitantes, en cada etapa de extensión, la cantidad de diana de ADN se duplica, lo que lleva a la amplificación exponencial del fragmento de ADN específico.
  • Elongación final: Este paso se lleva a cabo de vez en cuando a una temperatura de 70-74 º C durante 5-15 minutos después del último ciclo de la PCR para asegurarse de que cualquier ADN de hebra sencilla restante está totalmente extendido.
  • Retención final: Este paso a 4-15 C por tiempo indefinido se puede emplear para el almacenamiento a corto plazo de la reacción.

Para comprobar si el generado por PCR el fragmento de ADN esperado, electroforesis en gel de agarosa se emplea para el tamaño de la separación de los productos de PCR. El tamaño de los productos de PCR se determina mediante comparación con una escalera de ADN, que contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, se ejecutan en el gel junto con los productos de la PCR.

Etapas de PCR

El proceso de la PCR se puede dividir en tres etapas:

Amplificación exponencial: En cada ciclo, la cantidad de producto se duplica. La reacción es muy sensible: sólo cantidades mínimas de ADN deben estar presentes.

Nivelación del escenario: La reacción se ralentiza como la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos como dNTP y cebadores hace que se limita.

Meseta: No más producto se acumula debido al agotamiento de los reactivos y enzimas.

Optimización de PCR

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, en parte debido a su sensibilidad a la contaminación que causa la amplificación de productos de ADN no esenciales. Debido a esto, una serie de técnicas y procedimientos se han desarrollado para la optimización de las condiciones de PCR. La contaminación con ADN extraño se dirige a los protocolos y procedimientos de laboratorio que las mezclas pre-PCR separadas de potenciales contaminantes de ADN. Esto normalmente implica la separación espacial de las zonas PCR-configuración de las áreas de análisis o purificación de productos de PCR, el uso de utensilios de plástico desechables y limpieza a fondo de la superficie de trabajo entre configuraciones de reacción. Primer técnicas de diseño son importantes en la mejora de rendimiento de producto de PCR y en evitar la formación de productos no esenciales, y el uso de los componentes del tampón alternos o enzimas polimerasa pueden ayudar con la amplificación de las regiones largas o de otra problemática de ADN. La adición de reactivos, tales como formamida, en sistemas de tampón puede aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. Las simulaciones por ordenador de los resultados teóricos de PCR se pueden realizar para ayudar en el diseño del cebador.

Aplicación de la PCR

Aislamiento de ADN selectiva

PCR permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico mediante amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de la PCR aumenta los muchos métodos, tales como la generación de sondas de hibridación para la hibridación de Southern o el norte y la clonación de ADN, que requieren grandes cantidades de ADN, lo que representa una región de ADN específica. PCR suministra estas técnicas con altas cantidades de ADN puro, que permite el análisis de muestras de ADN incluso de muy pequeñas cantidades de material de partida.

Otras aplicaciones de PCR incluyen la secuenciación para determinar las secuencias de PCR amplificados desconocidos en el que uno de los cebadores de amplificación pueden ser utilizados en la secuenciación de Sanger, el aislamiento de una secuencia de ADN para acelerar tecnologías de ADN recombinante que implican la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido o el ADN material genético de otro organismo. Las colonias bacterianas se pueden cribar rápidamente por PCR para las construcciones correctas de vectores de ADN. PCR también se puede utilizar para la huella dactilar genética; una técnica forense se utiliza para identificar a una persona u organismo mediante la comparación de los ADN experimentales a través de diferentes métodos basados en la PCR.

Algunos métodos de PCR 'huellas dactilares' tienen un alto poder de discriminación y pueden ser utilizados para identificar las relaciones genéticas entre los individuos, como entre padres e hijos o entre hermanos, y se utilizan en las pruebas de paternidad. Esta técnica también se puede utilizar para determinar las relaciones evolutivas entre organismos.

Amplificación y cuantificación de ADN

Debido a que la PCR amplifica las regiones de ADN que se dirige, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto es a menudo crítico para el análisis forense, cuando sólo una cantidad traza de ADN está disponible como prueba. PCR también se puede utilizar en el análisis de ADN antiguo que es decenas de miles de años de antigüedad. Estas técnicas basadas en PCR han sido utilizados con éxito en animales, como por ejemplo un año cuarenta mil viejo mamut, y también en el ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de las momias egipcias a la identificación de un zar de Rusia y el cuerpo del rey británico Richard III.

Métodos de PCR cuantitativos permiten la estimación de la cantidad de una secuencia dada presente en una muestra-una técnica aplicada a menudo para determinar cuantitativamente los niveles de expresión génica. PCR en tiempo real es una herramienta establecida para la cuantificación de ADN que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.

PCR en el diagnóstico de enfermedades

PCR permite el diagnóstico precoz de enfermedades malignas como la leucemia y los linfomas, que es actualmente el más alto-desarrolladas en la investigación del cáncer y que ya se están utilizando de forma rutinaria. Los ensayos de PCR se pueden realizar directamente en muestras de ADN genómico para detectar células malignas translocación-específicos en una sensibilidad que es al menos 10.000 veces más alta que la de otros métodos.

PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento, como micobacterias, bacterias anaeróbicas, o virus de los ensayos de cultivo de tejidos y modelos animales. La base para aplicaciones de diagnóstico de PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de no patógena a partir de cepas patógenas en virtud de genes específicos.

El ADN viral del mismo modo se puede detectar por PCR. Los cebadores utilizados tienen que ser específicos para las secuencias específicas en el ADN de un virus, y la PCR se pueden utilizar para los análisis de diagnóstico o de secuenciación de ADN del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite la detección de virus pronto después de la infección e incluso antes de la aparición de la enfermedad. Dicha detección temprana puede dar a los médicos un tiempo considerable en el tratamiento. La cantidad de virus en un paciente también puede ser cuantificado mediante técnicas de cuantificación de ADN basados en PCR.

Las variaciones en la técnica básica PCR

  • PCR alelo-específica: una técnica de diagnóstico o clonación en base a las variaciones de un solo nucleótido. Se requiere conocimiento previo de una secuencia de ADN, incluyendo diferencias entre alelos, y utiliza cebadores cuyos extremos 3 'abarcar el SNV. Amplificación por PCR en condiciones rigurosas es mucho menos eficiente en la presencia de una falta de coincidencia entre la plantilla y el cebador, la amplificación tanto éxito con un cebador de señales SNP específico de la presencia del SNP específico en una secuencia. Ver SNP genotipificación para más información.
  • Asamblea PCR o la Asamblea Ciclismo Polimerasa: síntesis artificial de secuencias largas de ADN mediante la realización de PCR en un grupo de oligonucleótidos largos con segmentos superpuestos cortos. Los oligonucleótidos alternos entre sentido y antisentido direcciones, y los segmentos superpuestos determinan el orden de los fragmentos de PCR, produciendo de ese modo selectivamente el producto final de ADN de largo.
  • PCR asimétrica: amplifica preferentemente una cadena de ADN en un molde de ADN de cadena doble. Se utiliza en la secuenciación e hibridación de sondeo donde se requiere la amplificación de sólo una de las dos cadenas complementarias. PCR se llevó a cabo como de costumbre, pero con un gran exceso de la imprimación para la hebra dirigida para la amplificación. Debido a la amplificación lento más tarde en la reacción después de que el cebador limitante se ha usado arriba, se requieren ciclos adicionales de PCR. Una modificación reciente en este proceso, conocido como lineal-Después-La-exponencial-PCR, se utiliza un cebador que limita con una temperatura de fusión más alto que el exceso de cebador para mantener la eficacia de la reacción como la concentración de cebador limitante disminuye mediados de reacción.
  • Llamada saliente PCR: un método altamente paralelo para recuperar las moléculas de ADN precisas para la síntesis de genes. Una biblioteca de complejos de moléculas de ADN se modifica con las etiquetas de acompañamiento únicas antes de secuenciación masiva en paralelo. Tag-cebadores dirigidos a continuación, permiten la recuperación de moléculas con secuencias deseadas mediante PCR.
  • Amplificación helicasa dependiente: similar a la PCR tradicional, pero usa una temperatura constante en lugar de ciclismo a través de los ciclos de desnaturalización y reasociación/extensión. ADN helicasa, una enzima que desenrolla el ADN, se utiliza en lugar de la desnaturalización térmica.
  • PCR de arranque en caliente: de una técnica que reduce la amplificación no específica durante el conjunto inicial hasta las etapas de la PCR. Se puede realizar manualmente mediante el calentamiento de los componentes de la reacción a la temperatura de desnaturalización antes de la adición de la polimerasa. Sistemas enzimáticos especializados se han desarrollado que inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea por la unión de un anticuerpo o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que se disocian sólo después de una etapa de activación de alta temperatura. Hot-start/cold-finish PCR se consigue con nuevas polimerasas híbridas que son inactivos a temperatura ambiente y se activan al instante a la temperatura de alargamiento.
  • PCR Intersequence específico: un método de PCR para la identificación del ADN que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella digital única de longitud de los fragmentos amplificados.
  • La PCR inversa: se utiliza comúnmente para identificar las secuencias flanqueantes alrededor de insertos genómicos. Se trata de una serie de digestiones de ADN y la ligadura de uno mismo, lo que resulta en secuencias conocidas en cualquiera de los extremos de la secuencia desconocida.
  • La ligación mediada por PCR: utiliza pequeños enlazadores de ADN se ligó al ADN de interés y múltiples cebadores de recocido para los enlazadores de ADN, sino que se ha utilizado para la secuenciación de ADN, el genoma de caminar, y la huella de ADN.
  • PCR metilación específica: desarrollado por Stephen Baylin y Jim Herman en la Escuela de Medicina Johns Hopkins, y se utiliza para detectar la metilación de islas CpG en el ADN genómico. ADN se trata primero con bisulfito de sodio, que convierte las bases de citosina no metilados en uracilo, que es reconocido por los cebadores de PCR como timina. Dos PCR se llevaron a cabo a continuación, en el ADN modificado, utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto en ningún islas CpG dentro de las secuencias de los cebadores. En estos puntos, un conjunto de cebadores reconoce ADN con citosinas para amplificar el ADN metilado, y un conjunto reconoce ADN con uracilo o timina para amplificar el ADN no metilado. MSP utilizando qPCR también se puede realizar para obtener cuantitativa en lugar de la información cualitativa acerca de metilación.
  • Miniprimer PCR: utiliza una polimerasa termoestable que puede extenderse a partir de cebadores cortos tan corto como 9 o 10 nucleótidos. Este método permite PCR dirigidos a las regiones de unión del cebador más pequeños, y se utiliza para amplificar secuencias de ADN conservadas, tales como el gen de ARNr 16S.
  • Multiplex Ligadura dependiente Probe Amplification: permite múltiples objetivos para ser amplificados con sólo un único par de cebadores, evitando de este modo las limitaciones de resolución de PCR multiplex.
  • Multiplex-PCR: se compone de múltiples conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de diferentes tamaños que son específicos para diferentes secuencias de ADN. Al dirigirse a varios genes a la vez, la información adicional puede ser obtenida en una prueba de gestión única que de otro modo requeriría varias veces los reactivos y más tiempo para llevar a cabo. Recocido temperaturas para cada uno de los conjuntos de cebadores deben ser optimizadas para funcionar correctamente dentro de una sola reacción, y tamaños de amplificación. Es decir, su longitud de pares de bases debe ser lo suficientemente diferentes como para formar bandas distintas cuando se visualizó mediante electroforesis en gel.
  • Nested PCR: aumenta la especificidad de la amplificación de ADN, mediante la reducción de fondo debido a la amplificación no específica de ADN. Dos conjuntos de cebadores se utilizan en dos PCR sucesivas. En la primera reacción, un par de cebadores se usa para generar productos de ADN, que además del objetivo previsto, todavía puede consistir en no-específicamente fragmentos de ADN amplificados. El producto se utiliza a continuación, en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de unión son completamente o parcialmente diferente de y situado 3 'de cada uno de los cebadores utilizados en la primera reacción. Nested PCR es a menudo más éxito en la amplificación de fragmentos largos de ADN específicamente que la PCR convencional, pero que requiere un conocimiento más detallado de las secuencias diana.
  • Superposición-PCR de extensión o de empalme por extensión de superposición: una técnica de ingeniería genética que se utiliza para empalmar juntos dos o más fragmentos de ADN que contienen secuencias complementarias. Se utiliza para unir piezas de ADN que contienen los genes, secuencias reguladoras, o mutaciones, la técnica permite la creación de construcciones de ADN específicas y largo. También puede introducir deleciones, inserciones o mutaciones puntuales en una secuencia de ADN.
  • PCR cuantitativa: se utiliza para medir la cantidad de una secuencia diana. Se mide cuantitativamente cantidades de partida de ADN, ADNc, o ARN. qPCR se utiliza comúnmente para determinar si una secuencia de ADN está presente en una muestra y el número de sus copias en la muestra. PCR cuantitativa en tiempo real tiene un muy alto grado de precisión. Métodos de QRT-PCR utilizan colorantes fluorescentes, tales como SYBR Green, EvaGreen o sondas de ADN fluoróforo que contienen, tales como TaqMan, para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real. También se abrevia a veces a RT-PCR o RQ-PCR. QRT-PCR o RTQ-PCR contracciones son más apropiadas, ya que la RT-PCR se refiere comúnmente a la transcripción reversa de PCR, a menudo se utiliza junto con qPCR.
  • La PCR digital: utilizado para medir la cantidad de una secuencia de ADN diana en una muestra de ADN. La muestra de ADN está altamente diluido de manera que después de ejecutar muchas reacciones de PCR en paralelo, algunos de ellos no recibirán una sola molécula del ADN diana. La concentración de ADN diana se calcula utilizando la proporción de resultados negativos. De ahí el nombre 'PCR digital ".
  • PCR de transcripción inversa: para amplificar el ADN a partir de ARN. Inversa de la transcriptasa inversa transcribe el ARN en ADNc, que se amplifica a continuación mediante PCR. RT-PCR es ampliamente utilizado en perfiles de expresión, para determinar la expresión de un gen o para identificar la secuencia de un transcrito de ARN, incluyendo inicio de la transcripción y sitios de terminación. Si se conoce la secuencia de ADN genómico de un gen, RT-PCR se puede utilizar para mapear la ubicación de los exones y los intrones en el gen. El extremo 5 'de un gen que normalmente se identifica por RACE-PCR.
  • Fase Sólida PCR: abarca varios significados, incluyendo amplificación Polony, Puente de PCR, PCR en fase sólida convencional y mejorada en fase sólida PCR.
  • Térmica PCR asimétrica entrelazado: para el aislamiento de una secuencia desconocida que flanquean una secuencia conocida. Dentro de la secuencia conocida, COLA-PCR utiliza un par de cebadores anidados con diferentes temperaturas de recocido; un cebador degenerado se utiliza para amplificar en la otra dirección a partir de la secuencia desconocida.
  • Touchdown PCR: una variante de la PCR que tiene como objetivo reducir el fondo no específica mediante la reducción gradual de la temperatura de templado a medida que avanza PCR ciclismo. La temperatura de hibridación en los ciclos iniciales es por lo general unos pocos grados por encima de la Tm de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores, es unos pocos grados por debajo de la Tm de imprimación. Las temperaturas más altas dan una mayor especificidad para la unión de cebadores, y las temperaturas más bajas permiten la amplificación más eficiente de los productos específicos que se forman durante los ciclos iniciales.
  • PAN-AC: utiliza condiciones isotérmicas para la amplificación, y puede ser utilizado en las células vivas.
  • Universal caminar rápido: genoma para caminar y huellas dactilares genéticas mediante PCR una más específica 'dos caras' que los enfoques convencionales 'una cara' en virtud de un mecanismo que implica la formación de la estructura de lazo. Derivados simplificados de UFW son RAGE Lane, 5'RACE Lane y 3'RACE Lane.
  • En silico PCR se refiere a herramientas computacionales utilizadas para calcular los resultados de reacción en cadena de polimerasa teóricas utilizando un determinado conjunto de cebadores para amplificar secuencias de ADN de un genoma secuenciado o transcriptoma.

Historia

Un documento de 1971 en el Journal of Molecular Biology por Kleppe y compañeros de trabajo descrito por primera vez un método que utiliza un ensayo enzimático para replicar una plantilla corta de ADN con cebadores in vitro. Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de PCR no ha recibido mucha atención, y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 se atribuye generalmente a Kary Mullis.

Cuando Mullis desarrolló la PCR en el año 1983, trabajaba en Emeryville, California por Cetus Corporation, una de las primeras empresas de biotecnología. Allí, fue responsable de la síntesis de cadenas cortas de ADN. Mullis ha escrito que él concibió de la PCR durante la navegación a lo largo de la costa del Pacífico de una noche en su coche. Él estaba jugando en su mente con una nueva forma de analizar los cambios en el ADN cuando se dio cuenta de que en lugar de eso se había inventado un método para amplificar una región del ADN a través de repetidos ciclos de duplicación impulsados por la ADN polimerasa. En Scientific American, Mullis resumió el procedimiento:. ". A partir de una sola molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de moléculas similares en una tarde, la reacción es fácil de ejecutar que no requiere más que un tubo de ensayo, un algunos reactivos sencillos, y una fuente de calor. " Fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1993 por su invención, siete años después de que él y sus colegas de Cetus primero puso su propuesta a la práctica. Sin embargo, algunas controversias se han mantenido sobre las contribuciones intelectuales y prácticas de otros científicos a trabajos Mullis ", y si él había sido el único inventor del principio PCR.

En el núcleo del método de PCR es el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de soportar las altas temperaturas de> 90 º C requerido para la separación de las dos hebras de ADN en la doble hélice del ADN después de cada ciclo de replicación. Las ADN polimerasas empleadas inicialmente para los experimentos in vitro presagian PCR fueron incapaces de resistir estas altas temperaturas. Así que los primeros procedimientos para la replicación del ADN estaban consumiendo muy ineficiente y el tiempo, y grandes cantidades de ADN polimerasa y la manipulación continua durante todo el proceso requerido.

El descubrimiento en 1976 de Taq polimerasa - una polimerasa de ADN purificado a partir de la bacteria termófila, Thermus aquaticus, que, naturalmente, vive en ambientes calientes), tales como manantiales de agua caliente - allanado el camino para mejoras dramáticas del método de PCR. La polimerasa de ADN aislado a partir de T. aquaticus es estable a altas temperaturas que permanecen activas incluso después de la desnaturalización del ADN, obviando así la necesidad de añadir nueva ADN polimerasa después de cada ciclo. Esto permitió que un proceso basado en termociclador automatizado para la amplificación de ADN.

Guerras de patente

La técnica de PCR fue patentado por Kary Mullis y asignado a Cetus Corporation, donde Mullis trabajaba cuando inventó la técnica en 1983 - La enzima Taq polimerasa también fue cubierta por las patentes. Ha habido varios juicios de alto perfil relacionados con la técnica, incluyendo un pleito fracasado presentada por DuPont. La compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche compró los derechos de las patentes en 1992 y actualmente ocupa los que todavía están protegidos.

Una batalla de patentes relacionadas con el enzima polimerasa Taq está todavía en curso en varias jurisdicciones de todo el mundo entre Roche y Promega. Los argumentos jurídicos se han extendido más allá de la vida de la PCR original y patentes de Taq polimerasa, que expiró el 28 de marzo de 2005.