Ureasa, Características, Sitio de Active, Actividad de la ureasa, Los mecanismos propuestos para la ureasa, Acción de la ureasa en la patogénesis, Como prueba de diagnóstico, Otros usos

Ureasas, funcionalmente, pertenecen a la superfamilia de amidohydrolases y phosphotriestreases. Es una enzima que cataliza la hidrólisis de la urea en dióxido de carbono y amoníaco. La reacción se produce de la siguiente manera:

 2CO H2O? CO2 2NH3

Más específicamente, la ureasa cataliza la hidrólisis de urea para producir amoniaco y carbamato, el carbamato producido posteriormente es degradado por hidrólisis espontánea para producir otro amoniaco y ácido carbónico. Actividad de ureasa tiende a aumentar el pH del medio ambiente en el que es, ya que produce amoniaco, ya que es una molécula básica. Ureasas se encuentran en numerosas bacterias, hongos, algas, plantas y algunos invertebrados, así como en los suelos, como una enzima del suelo. Ellos son metaloenzimas que contienen níquel de alto peso molecular.

En 1926, James B. Sumner, un profesor asistente en la Universidad de Cornell, mostró que la ureasa es una proteína mediante el examen de su forma cristalizada. El trabajo de Sumner fue la primera demostración de que una proteína pura puede funcionar como una enzima, y condujo finalmente al reconocimiento de que la mayoría de las enzimas que se encuentran en las proteínas de datos, y la concesión del premio Nobel de Química a Sumner en 1946. La estructura de la ureasa fue resuelto por primera vez por PA Karplus en 1995 - La ureasa fue la primera enzima vez cristalizada.

Características

  • El sitio activo que requiere níquel en Jack frijoles y diversas bacterias. Sin embargo, la activación in vitro también se ha conseguido con el manganeso y el cobalto
  • Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para Jack haba ureasa. 840 amino ácidos por molécula, de las cuales 90 son cisteínas.
  • PH óptimo: 7.4
  • Temperatura óptima: 60 grados Celsius
  • Especificidad enzimática: la urea y la hidroxiurea
  • Inhibidores: metales pesados

 Ureasas bacterianas se componen de tres subunidades distintas, uno grande y dos pequeños comúnmente la formación de trímeros 3 estequiometría con una estructura simétrica de 2 veces, que son ricos en cisteína enzimas, lo que resulta en las masas molares de enzimas entre 190 y 300kDa.

Una enzima excepcional es la ureasa de las especies de Helicobacter, que se compone de dos subunidades, una-, y se ha demostrado para formar un complejo supramolecular dodecameric de repetir un subunidades, cada par acoplado de subunidades tiene un sitio activo, para una total de 12 sitios activos .. Desempeña una función esencial para la supervivencia, neutralizar el ácido gástrico, permitiendo de urea para entrar en periplasma de urea a través de un canal regulado por protones. La presencia de ureasa se utiliza en el diagnóstico de especies de Helicobacter.

Todos los ureasas bacterianas son exclusivamente citoplásmica, a excepción de la ureasa de Helicobacter pylori, que junto con su actividad citoplasmática, que tiene actividad externa con células huésped. En contraste, todas las ureasas de plantas son citoplasmática.

Ureasas por hongos y plantas se componen de subunidades idénticas, más comúnmente ensamblan como trímeros y hexámeros. Por ejemplo, Jack haba ureasa tiene dos subunidad catalítica estructural y uno. La subunidad contiene el sitio activo, que se compone de 840 aminoácidos ácidos por molécula, su masa molecular y sin iones Ni por valor de 90,77 kDa. La masa de la hexámero con los 12 iones de níquel es 545,34 kDa. Está estructuralmente relacionado con el trímero de 3 ureasas bacterianas. Otros ejemplos de estructuras homohexameric de ureasas planta son los de soja, guandul y enzimas de las semillas de algodón.

Es importante señalar, que aunque compone de diferentes tipos de subunidades, ureasas de diferentes fuentes que se extienden desde las bacterias a las plantas y los hongos presentan una alta homología de secuencias de aminoácidos.

Sitio de Active

El sitio activo de todos ureasas conocidos están situados en una de las subunidades. Es un bis - hidroxo centro níquel dimérica, con una distancia interatómico de ~ 3.5, experimentos de susceptibilidad magnética han indicado que, en Jack haba ureasa, la alta rotación octaédricamente coordinado iones Ni están débilmente acoplados antiferromagnetically .. Los iones de níquel puenteados por una lisina carbamilada a través de sus átomos de O-y por un ion hidróxido. Ni es coordinado por átomos de N de los residuos de histidinas y una molécula de agua, que se dice que es piramidal cuadrada seudo. Ni está coordinado por dos histidinas también a través de átomos de N y, además, por el ácido aspártico a través de su átomo de O y 2 moléculas de agua. De rayos X los estudios de espectroscopia de absorción de Canavalia ensiformis, Klebsiella aerogenes y Sporosarcina pasteurii confirman 5-6 coordinar iones de níquel con ligandos exclusivamente S/N.

Las moléculas de agua se encuentran hacia la abertura del sitio activo y forman un clúster tetraédrico que llena el sitio de la cavidad a través de enlaces de hidrógeno, y es aquí donde la urea se une al sitio activo para la reacción, desplazando el agua de los residuos de aminoácidos molecules.The participan en la unión del sustrato, principalmente a través de enlaces de H, estabilizar el estado de transición catalítica y acelerar la reacción. Además, los residuos de aminoácidos implicados en la arquitectura del sitio activo componen parte de la aleta móvil del sitio, que se dice que actúa como una puerta para el sustrato. Los residuos de cisteína son comunes en la región de la solapa de los enzimas, que han sido determinados a no ser esencial en la catálisis, a pesar de participar en el posicionamiento de otros residuos clave en el sitio activo apropiadamente. En la estructura de Sporosarcina pasteurii ureasa se encontró que el colgajo en la conformación abierta, mientras que su conformación cerrada es aparentemente necesario para la reacción.

En comparación, las subunidades de la ureasa de Helicobacter pylori y otras bacterias ureasas alinean con los ureasas jack de frijol, lo que sugiere que todos los ureasas son variantes evolutivas de una enzima ancestral.

Nota: Es importante tener en cuenta que la coordinación de urea para el sitio activo de la ureasa nunca se ha observado en un estado de reposo de la enzima.

Actividad de la ureasa

La kcat/Km de la ureasa en el procesamiento de la urea es 1.014 veces mayor que la tasa de la reacción de eliminación no catalizada de urea.There son muchas razones para esta observación en la naturaleza. La proximidad de la urea a los grupos activos en el sitio activo, junto con la orientación correcta de urea permite la hidrólisis que se produzca rápidamente. Urea sola es muy estable debido a las formas de resonancia que puede adoptar. La estabilidad de la urea se entiende que es debido a su energía de resonancia, que ha sido estimado en kcal/mol.This 30-40 se debe a la resonancia de ion híbrido forma todos los donan electrones al carbono del carbonilo por lo que es menos de un electrófilo por lo que es menos reactiva al ataque nucleófilo.

Los mecanismos propuestos para la ureasa

El mecanismo propuesto Blakeley/Zerner

Un mecanismo para la catálisis de esta reacción por la ureasa fue propuesto por Blakely y Zerner. Se inicia con un ataque nucleofílico por el oxígeno del carbonilo de la molécula de urea en el Ni-5 de coordenadas. Un ligando agua débilmente coordinados se desplaza en su lugar. Un par solitario de electrones de uno de los átomos de nitrógeno en la molécula de urea crea un doble enlace con el carbono central, y la resultante NH2 del sustrato coordinada interactúa con un grupo cargado negativamente en las inmediaciones. Blakeley y Zerner propusieron este grupo cercano a ser una ion carboxilato

Un ligando de hidróxido en los seis coordenadas de Ni está desprotonado por una base. El carbono del carbonilo es posteriormente atacada por el oxígeno electronegativo. Un par de electrones del doble enlace nitrógeno-carbono devuelve al nitrógeno y neutraliza la carga sobre él, mientras que el ahora de carbono 4-coordenadas asume una orientación intermedio tetraédrico.

El desglose de este producto intermedio se ayudó a continuación, por un grupo sulfhidrilo de una cisteína localizado cerca del sitio activo. Un hidrógeno bonos a uno de los átomos de nitrógeno, rompiendo su enlace con el carbono, y la liberación de una molécula de NH3. Simultáneamente, el enlace entre el oxígeno y el níquel-6 de coordenadas se rompe. Esto deja un ion carbamato coordinado con el 5-coordenadas de Ni, que se desplaza entonces por una molécula de agua, la regeneración de la enzima.

El carbamato producido a continuación, se degrada sponaneously para producir otro amoniaco y ácido carbónico.

El mecanismo propuesto Hausinger/Karplus

El mecanismo propuesto por Hausinger y Karplus intenta revisar algunos de los problemas aparentes en el Blakely y vía Zerner, y se centra en las posiciones de las cadenas laterales que forman el bolsillo urea vinculante. A partir de las estructuras cristalinas de K. aerogenes ureasa, se argumentó que la base general que se utiliza en el mecanismo de Blakely, His320, estaba demasiado lejos del agua Ni2 determinado con el fin desprotonar con el fin de formar el radical hidróxido de atacar. Además, el ligando de ácido en general requiere para protonar el nitrógeno de la urea no fue identificado. Hausinger y Karplus sugiere un esquema de protonación inversa, donde una forma protonada del ligando His320 desempeña el papel del ácido general y el agua Ni2-enlazado ya está en el estado desprotonado. El mecanismo sigue el mismo camino, con la base general de omitido y His320 la donación de su protón para formar la molécula de amoniaco, que se libera a continuación de la enzima. Mientras que la mayoría de los ligandos His320 y agua unida no estará en sus formas activas se calculó que aproximadamente el 0,3% de enzima total de ureasa sería activo en un momento dado. Mientras que lógicamente, esto implicaría que la enzima no es muy eficiente, contrariamente al conocimiento establecido, el uso del esquema de protonación inversa proporciona una ventaja en el aumento de la reactividad de la forma activa, equilibrar la desventaja. La colocación del ligando His320 como un componente esencial en el mecanismo también tiene en cuenta la región aleta móvil de la enzima. Como este ligando histidina es parte de la aleta móvil, la unión del sustrato de urea para la catálisis cierra este colgajo sobre el sitio activo y con la adición del modelo de unión de hidrógeno a la urea de otros ligandos en el bolsillo, habla a la selectividad de la ureasa enzima para la urea.

El mecanismo propuesto Ciurli/Mangani

El mecanismo propuesto por Ciurli Mangani y es uno de los más recientes y actualmente aceptado vistas al mecanismo de la ureasa y se basa principalmente en los diferentes roles de los dos iones de níquel en el sitio activo. Uno de los cuales se une y activa la urea, la otra de iones de níquel se une y activa la molécula de agua nucleofílica. Con respecto a esta propuesta, la urea entra en la cavidad del sitio activo cuando la aleta móvil está abierto. La estabilidad de la unión de urea para el sitio activo se logra a través de una red de enlaces de hidrógeno, orientar el sustrato en la cavidad catalítica. La urea se une al níquel de cinco coordinada con el átomo de oxígeno del carbonilo. Se acerca al níquel de seis coordinada con uno de sus grupos amino y, posteriormente, une los dos centros de níquel. La unión de la urea carbonilo átomo de oxígeno para Ni1 se estabiliza a través del estado de protonación de Hisa222 N?. Además, el cambio conformacional desde el estado abierto al cerrado de la aleta móvil genera un reordenamiento de Alaa222 grupo carbonilo de tal manera que sus puntos átomo de oxígeno para Ni2. El Alaa170 y Alaa366 son ahora orientada de una manera que sus grupos carbonilo actúan como aceptores de enlaces de hidrógeno hacia el grupo NH2 de la urea, ayudando de esta manera su unión a Ni2. La urea es un ligando quelante muy pobre debido a la baja base de Lewis carácter de sus grupos NH2. Sin embargo los oxígenos carbonilo de Alaa170 y Alaa366 mejorar la basicidad de los grupos NH2 y permiten la unión a Ni2. Por lo tanto en este mecanismo propuesto, el posicionamiento de la urea en el sitio activo es inducida por las características estructurales de los residuos del sitio activo que se colocan para actuar como donantes de enlaces de hidrógeno en las proximidades de Ni1 y como aceptores en la vecindad de Ni2. La principal diferencia estructural entre el mecanismo de Ciurli/mangani y los otros dos son que incorpora un átomo de nitrógeno, oxígeno puente de urea que es atacado por un hidróxido de puente.

Acción de la ureasa en la patogénesis

Ureasas bacterianas son más a menudo el modo de patogénesis de muchas condiciones médicas. Están asociados con encefalopatía hepática/coma hepático, cálculos de la infección, y ulceración péptica.

 Piedras infección

Infección piedras urinarias inducidas son una mezcla de estruvita y carbonato apatita Estos iones polivalentes son solubles pero llegar a ser insolubles cuando el amoníaco se produce a partir de la ureasa microbiana durante la hidrólisis de la urea, ya que esto aumenta la rodea entornos de pH de aproximadamente 6,5 a 9 -. Las resultantes en la alcalinización cristalización de piedra. En los seres humanos la ureasa microbiana, Proteus mirabilis, es el más común en la infección inducida cálculos urinarios.

 La ureasa en la encefalopatía hepática/coma hepático

Los estudios han demostrado que el Helicobacter pylori junto con la cirrosis del hígado causa la encefalopatía hepática y el coma hepático. Helicobacter pylori son ureasas microbianas encontradas en el estómago. Como ureasas que hidrolizan la urea para producir amoniaco y el ácido carbónico. Como las bacterias se localizan en el estómago amoníaco producido se toma fácilmente por el sistema circulatorio de la luz gástrica. Esto se traduce en elevados niveles de amoníaco en la sangre y se acuñaron como hiperamonemia, la erradicación de Helicobacter pylori muestran marcada disminución en los niveles de amoníaco.

 La ureasa en Úlceras herpética

Helicobacter pylori es también la causa de las úlceras pépticas con su manifestación en el 55% -68% de los casos reportados .. Esto fue confirmado por una disminución de la hemorragia por úlcera y la úlcera vuelva a ocurrir después de la erradicación del patógeno. En el estómago se produce un aumento en el pH del revestimiento de la mucosa como resultado de la hidrólisis de la urea esta impide el movimiento de los iones de hidrógeno entre las glándulas gástricas y el lumen gástrico. Además, las altas concentraciones de amoníaco tienen un efecto sobre las uniones estrechas intercelulares el aumento de la permeabilidad y también romper la membrana mucosa gástrica del estómago.

Como prueba de diagnóstico

Muchos patógenos del tracto gastrointestinal o urinario producen ureasa, lo que permite la detección de ureasa para ser utilizado como un diagnóstico para detectar la presencia de patógenos.

Patógenos ureasa positivos incluyen:

  • Proteus mirabilis y Proteus vulgaris
  • Ureaplasma urealyticum, un pariente de Mycoplasma spp.
  • Nocardia
  • Campylobacter ureolyticus
  • Cryptococcus spp., Un hongo oportunista
  • Helicobacter pylori
  • Ciertas bacterias entéricas como Proteus spp., Klebsiella spp., Morganella, Providencia, y, posiblemente, Serratia spp.
  • Brucella

Otros usos

Ureasa biosensores conductometricos para la detección de iones de metales pesados

Ureasa conductometricos biosensores para la detección de iones de metales pesados que consisten en electrodos de oro interdigitados de enzimas y membranas formadas en sus partes sensibles se han utilizado para una estimación cuantitativa de la contaminación general del agua con iones de metales pesados. Las mediciones de la actividad residual de la ureasa se han llevado a cabo en Tris-HNO3> tampón después de la preincubación en solución de sal metálica modelo. Los límites de detección, dependiendo del tiempo de preincubación y rangos dinámicos han sido obtenidos de modelos de soluciones de iones de metales pesados. La secuencia de los iones de metales con relación a su toxicidad para la ureasa es: Hg2 > Cu2 > Cd2 > Co2 > Pb2 > Sr2 >. Las condiciones para las aplicaciones prácticas de los biosensores se han investigado y evaluado críticamente para la optimización. La ureasa reactivación por EDTA después de la inhibición por los iones de metales pesados se ha demostrado. Las características de funcionamiento del biosensor de conductividad son discutidos por GA Zhylyaka, SV Dzyadevichb, YI Korpana, AP y AV Soldatkina El'skayaa en su artículo.